Protocole de coloration du colorant de viabilité fixable ViaKrome
Matériaux
- PBS
- Sérum de veau fœtal
- Réactif PerFix-nc 1, 2 et 3 (Numéro de produit B10825)
- PBS avec 0,5% de formaldéhyde
Lignées cellulaires
- Utiliser des lignées cellulaires à raison de 5 x 106 cellules par ml, 100 μl par test (5 x 105 cellules par test)
- Ajouter 2,5 ul* de colorant de viabilité fixable ViaKrome
- Vortex
- Incuber entre 18 et 25 °C pendant 20 minutes, à l’abri de la lumière
- Ajouter 3 ml de PBS 1X
- Centrifuger à 300 g pendant 5 minutes
- Aspirer le surnageant
- Ajouter 500 μl de PBS 1X / 0,5 % de formaldéhyde.
- Recueillir des données à l'aide d'un cytomètre en flux
*Si vous souhaitez utiliser d'autres protocoles et/ou échantillons, une titration du colorant de viabilité fixable ViaKrome est recommandée afin de déterminer la dose optimale.
Coloration représentative à l'aide des colorants de viabilité fixables ViaKrome. Représentation bi-paramétrique (Diffusion orthogonale par rapport à Intensité de fluorescence) de la coloration d'un mélange de cellules non traitées (cellules vivantes) et de cellules Jurkat traitées thermiquement (cellules mortes). L'acquisition est effectuée à l’aide d’un cytomètre en flux CytoFLEX LX série N-V-B-Y-R-I et l'émission a été détectée via le filtre passe-bande indiqué. Le colorant ViaKrome 405 a été excité avec le laser violet (405 nm), panel A, le colorant ViaKrome 561 a été excité avec le laser jaune vert (561 nm), panel B, le colorant ViaKrome 638 a été excité avec le laser rouge (638 nm), panel C et le colorant ViaKrome 808 a été excité avec le laser infrarouge (808 nm), panel D.
Cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC)
- Ajouter 2,5 μl de colorant de viabilité fixable ViaKrome dans 50 μl de PBMC à 10 x 106 cellules/ml
- Vortex
- Incuber entre 18 et 25 °C pendant 20 minutes, à l’abri de la lumière
- Ajouter 3 ml de PBS 1X
- Centrifuger à 150 g pendant 5 minutes. Retirer le surnageant par aspiration.
- Ajouter 50 µl de sérum de veau fœtal. Vortexer jusqu'à séparation du culot.
- Procéder à la coloration intracellulaire
*Si vous souhaitez utiliser d'autres protocoles et/ou échantillons, une titration du colorant de viabilité fixable ViaKrome est recommandée afin de déterminer la dose optimale.
Coloration représentative à l'aide des colorants de viabilité fixables ViaKrome. Représentation bi-paramétrique (Diffusion orthogonale par rapport à intensité de fluorescence) de la coloration des cellules mononucléaires de sang périphérique (PMBC). L'acquisition est effectuée à l’aide d’un cytomètre en flux CytoFLEX LX série N-V-B-Y-R-I et l'émission a été détectée via le filtre passe-bande indiqué. Le colorant ViaKrome 405 a été excité avec le laser violet (405 nm), panel A, le colorant ViaKrome 561 a été excité avec le laser jaune vert (561 nm), panel B, le colorant ViaKrome 638 a été excité avec le laser rouge (638 nm), panel C et le colorant ViaKrome 808 a été excité avec le laser infrarouge (808 nm), panel D.