Dr. Andreas Böhmler, Director Strategic Marketing Clinical Solutions, Beckman Coulter Life Sciences, Krefeld, Germany

Besoins courants non satisfaits

Conformité avec les normes et recommandations internationales

Face à l'utilisation croissante de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) mobilisées dans le cadre de transplantations, Sutherland et al., en association avec l'International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE), rédigent en 1996 un ensemble de normes applicables à la numération de cellules CD34+ avec l'intention de proposer une méthode simple et sensible qui permettrait un fort taux de précision et de reproductibilité interlaboratoire. Le résultat, à savoir les « ISHAGE Guidelines », devient rapidement le texte de référence en matière de numération des cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ par cytométrie en flux¹. . En 1998, Keeney et al. publient une version modifiée des recommandations de 1996 qui inclut l'utilisation de billes pour la numération absolue, du 7-AAD en tant que marqueur de viabilité pour exclure les cellules mortes et d'un réactif de lyse ne contenant aucun fixateur². Ces modifications ont transformé le protocole de base en une méthode à plateforme unique et les « recommandations de l'ISHAGE concernant la plateforme unique avec marqueur de viabilité » qui en ont résulté n'ont été que légèrement modifiées depuis leur rédaction il y a plus de 20 ans.

La caractéristique des recommandations de l'ISHAGE est une stratégie de caractérisation séquentielle qui permet de déduire le nombre de cellules CD34+ des leucocytes viables. Les lignes directrices exigent également que les tests soient réalisés en double avec un contrôle négatif pour corriger la variabilité des tests et la liaison non spécifique des cellules et des fluorochromes. En raison de la sélectivité de la caractérisation séquentielle, l'utilisation d'un contrôle négatif a été rendue facultative par les auteurs des recommandations de l'ISHAGE au cours des années suivantes. Toutefois, la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) rend son utilisation obligatoire³. À la différence des recommandations de l'ISHAGE, les normes décrites dans la Pharmacopée européenne sont juridiquement contraignantes, comme le prévoient la Convention relative à l'élaboration d'une Pharmacopée européenne du Conseil de l'Europe et la législation pharmaceutique en vigueur au niveau national et dans l'UE.

Les solutions logicielles actuellement disponibles faisant partie d'un système de DIV n'offrent pas la flexibilité d'exécuter des panels pour la numération des CD34+ avec ou sans contrôle négatif tout en conservant le statut de DIV. En outre, les kits de réactifs de numération des cellules CD34+ ne contiennent pas tous un réactif de contrôle négatif.

Bien que le point de départ de la stratégie de caractérisation séquentielle ISHAGE, à savoir les leucocytes viables, facilite considérablement la quantification correcte des populations rares de cellules CD34+, il en résulte au final que toutes les cellules CD34+ dénombrées sont automatiquement viables et qu'il peut être difficile de calculer directement le pourcentage de cellules CD34+ viables parmi toutes les cellules CD34+. En outre, il peut être difficile de déterminer le nombre total de leucocytes CD45+ à partir de la stratégie de caractérisation appliquée pour évaluer la viabilité globale de l'échantillon⁷.

En ce qui concerne les cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical, la 7e édition récemment publiée des « Normes internationales NetCord-FACT relatives à la collecte, au stockage et à l'administration de sang issu du cordon ombilicaln » exige la numération totale des CD34+ et la numération totale des CD34+ viables pour le post-traitement des échantillons de sang de cordon ombilical avant la cryoconservation, ainsi que l'évaluation du pourcentage de viabilité des CD34+ avant la libération d'une unité de sang de cordon ombilical pour le programme clinique⁴.

Numération des CD34+ à des fins de contrôle qualité (CQ)

Lorsque la quantification des CD34+ est effectuée à des fins de contrôle qualité, les laboratoires recherchent la possibilité de ne pas exécuter le panel ISHAGE complet, composé de tests en double et d'un contrôle négatif, mais plutôt un test unique, notamment lorsque seuls de petits volumes d'échantillons sont disponibles pour l'analyse. Les logiciels d'acquisition actuels n'offrent pas la flexibilité nécessaire pour adapter le panel en conséquence dans le cadre de la solution de diagnostic in vitro. Bien qu'un système de DIV ne soit pas absolument nécessaire pour le contrôle qualité, la plupart des laboratoires effectuant ces tests sont très réglementés et s'abstiennent donc de valider un test défini par l'utilisateur distinct uniquement à cette fin.

Traçabilité des échantillons et des réactifs

Les laboratoires effectuant la numération des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) CD34+ sont très réglementés en matière de traçabilité des données et doivent mettre en place un système de contrôle qualité étendu, en particulier lorsqu'ils sont soumis à une homologation (6). Les aspects clés de ces mécanismes de contrôle comprennent notamment :

• La prévention des erreurs d'identification des échantillons lors du processus au moyen d'une identification adéquate de tous les échantillons,
• Des dispositions adéquates de contrôle de la fiabilité, de l'exactitude, de la précision et des performances des procédures et instruments de test,
• Des contrôles fonctionnels des instruments et réactifs,
• L'utilisation de matériel de référence approprié et la documentation des tests de compétences continus,
• Un processus empêchant l'utilisation de réactifs et de consommables expirés,
• Un mécanisme permettant d'associer le numéro de lot, la date d'expiration et le fabricant des consommables et réactifs à chaque échantillon.

Ces deux derniers points peuvent être particulièrement difficiles, car la documentation des réactifs et des échantillons n'est souvent pas liée et se fait « hors ligne » et, donc, en dehors de la plateforme d'acquisition et d'analyse des données.s.

Automatisation des laboratoires

Dans les laboratoires d'onco-hématologie, les échantillons de cellules HPC sont souvent catégorisés comme échantillons urgents à leur réception et nécessitent d'être traités en priorité, ce qui perturbe le flux de travail. Tout problème lié à ces échantillons multiplie les efforts à fournir et augmente le risque d'erreur humaine. Pour ces laboratoires, il serait préférable d'intégrer les échantillons de cellules HPC au flux de travail ordinaire, de préférence d'une manière qui réduise le risque d'erreurs d'échantillonnage ou tout autre problème, car la rapidité d'analyse de cellules HPC CD34+ est essentielle. Pour les laboratoires spécialisés dans la numération des CD34+, tels que les établissements de sang de cordon ombilical, une automatisation accrue permettrait de gérer le nombre croissant d'échantillons à analyser, tout en assurant une traçabilité élevée, comme décrit ci-dessus.

Les solutions actuelles de DIV pour la numération des CD34+ par cytométrie en flux manquent de capacité d'automatisation, principalement parce qu'elles utilisent des réactifs de lyse des globules rouges qui affectent négativement la viabilité des cellules. Ainsi, les échantillons préparés doivent être conservés sur la glace avant l'analyse. Les recommandations de l'ISHAGE suggèrent l'utilisation du chlorure d'ammonium. En effet, il s'agissait du seul réactif de lyse disponible à l'époque convenant à une approche de lyse/sans lavage ne nécessitant pas de fixateurs supplémentaires et n'altérant pas les propriétés de diffusion de la population cellulaire d'intérêt. Bien que l'utilisation du chlorure d'ammonium soit bien établie dans pratiquement tous les kits commerciaux de numération des CD34+ pour la cytométrie en flux, celle-ci empêche la mise en œuvre des tests CD34+ sur les plateformes automatisées de préparation d'échantillons et de cytométrie en flux en raison de son effet sur la viabilité des cellules et parce que la dilution de travail doit être préparée quotidiennement.

Aujourd'hui, il existe des réactifs de lyse des globules rouges prêts à l'emploi qui lysent spécifiquement les globules rouges sans impact prononcé sur la viabilité des leucocytes pendant la préparation de l'échantillon, ce qui permet de réaliser la numération des CD34+ sur un système automatisé de cytométrie en flux.

Évolution de la norme de référence

Un kit de quantification des CD34+ de nouvelle génération pour la cytométrie en flux combine les avantages des normes et protocoles établis avec une flexibilité suffisante pour adapter les outils réactifs et logiciels aux besoins actuels des laboratoires cliniques. Il inclut des panels d'acquisition et d'analyse pour les différents besoins du laboratoire sans nul besoin de mettre en place des tests définis par l'utilisateur parallèlement aux solutions de DIV. Il comprend également des mécanismes de contrôle qualité répondant aux exigences d'un environnement de travail très réglementé, tout en offrant un degré d'automatisation élevé (figure 1).

Figure 1. Caractéristiques d'une solution pour l'identification et la quantification des cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ répondant aux exigences des laboratoires cliniques d'aujourd'hui (sur la base d'une étude de marché quantitative).

Système AQUIOS STEM

Le système AQUIOS STEM a été conçu en collaboration avec des experts de premier plan dans le domaine de la numération clinique des CD34+ dans le but de repousser les limites de la norme de référence. Cette approche modulaire de l'analyse automatisée des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34+ sur le cytomètre en flux AQUIOS CL (tableau 1) se compose des éléments suivants :

• Logiciel AQUIOS STEM pour le cytomètre en flux AQUIOS CL,
• Réactifs du kit AQUIOS STEM pour la numération des CD34+,
• Cellules de contrôle AQUIOS STEM CD34 (2 niveaux).

Flexibilité des panels

Le logiciel AQUIOS STEM offre un total de trois panels d'acquisition différents pour la numération clinique des CD34+ (figure 2). Tous les protocoles suivent la stratégie de caractérisation séquentielle des recommandations de l'ISHAGE. Les panels offrent la possibilité de réaliser le panel « complet » de trois tests (test en double plus contrôle négatif) comme l'ISHAGE le suggère et comme la Pharmacopée Européenne l'exige, le panel ISHAGE facultatif sans contrôle négatif, ou un seul test pouvant être utilisé à des fins de CQ pour les types d'échantillons rares. Toutes les combinaisons de panels font partie de la solution de DIV sans qu'il soit nécessaire de créer des tests définis par l'utilisateur.

Figure 2. Options de panels du système AQUIOS STEM pour la quantification clinique des HPC CD34+.

Solutions d'anticorps et de réactifs

Les réactifs du kit AQUIOS STEM comprennent un réactif d'anticorps monoclonaux murins CD45-FITC/CD34-PE, un contrôle négatif correspondant (CD45-FITC/CD34-CTRL), un réactif de numération absolue (fluorosphères AQUIOS STEM-Count), un réactif de viabilité cellulaire (7-AAD) et un réactif de lyse prêt à l'emploi. Le kit contient suffisamment de réactif pour analyser 50 échantillons en double, plus un contrôle négatif. Les réactifs pour CD34 et CD45 contiennent les clones recommandés par les recommandations de l'ISHAGE.

Le tableau 2 présente une liste de tous les composants du système AQUIOS STEM. Le tableau 3 offre un aperçu des paramètres et des types d'échantillons pouvant être analysés avec le système AQUIOS STEM.

Concept d'automatisation

Le cytomètre en flux AQUIOS CL simplifie les opérations en intégrant le chargement automatisé, la préparation des échantillons, la gestion des réactifs et la lecture des codes-barres, ainsi que l'analyse des données et la connectivité bidirectionnelle avec le système d'information de laboratoire (SIL) au sein d'une plateforme compacte. C'est ce que nous appelons la cytométrie en flux Load & Go (cytomètre autonome à charger).

Le logiciel AQUIOS STEM permet d'ajouter la numération des CD34+ au portefeuille d'applications AQUIOS CL existant. Ainsi, la plupart des étapes du processus peuvent être automatisées. Pour ce faire, on utilise un réactif de lyse des globules rouges qui répond aux critères des recommandations de l'ISHAGE (aucun lavage, aucun ajout de fixateurs, aucune altération des caractéristiques de diffusion de la population cible) mais qui peut être stocké et manipulé à température ambiante. En outre, ce réactif est prêt à l'emploi sans qu'il soit nécessaire de préparer quotidiennement une dilution de travail à partir de solutions en stock. Enfin, il est doux pour les populations d'intérêt.

La solution de billes utilisée pour la numération absolue présente une flottabilité soigneusement équilibrée et ne nécessite pas d’agitation individuelle avant chaque étape de pipetage. De plus, le flacon contenant les billes est muni d'un bouchon spécial empêchant l'évaporation.

Les échantillons sont chargés soit à l'aide du chargeur automatique de cassettes de l'AQUIOS CL, soit à l'aide du chargeur de tube unique pour échantillons urgents, ceux-ci étant alors prioritaires par rapport aux autres échantillons de la liste d'attente. Cela garantit un flux de travail continu sans qu'il soit nécessaire d'interrompre les processus en cours. La préparation des échantillons s'effectue dans des plaques à 96 puits profonds, avec des sondes individuelles pour la préparation et l'analyse des échantillons. Les deux étapes ont ainsi lieu en parallèle et les échantillons sont analysés aussitôt la préparation des échantillons terminée.

Figure 3. Le chargeur automatique accepte diverses tailles de tubes et peut charger jusqu'à 40 échantillons à la fois, avec une fonctionnalité de chargement et de déchargement aléatoire continu. Le système utilise un lecteur de code-barres interne pour le suivi positif des échantillons du chargeur automatique. L'ID échantillon correspond à la demande et les informations patient sont facilement accessibles tout au long du traitement des échantillons. Un chargeur de tube unique distinct est disponible pour les échantillons urgents, les échantillons en flacon ouvert ou les tubes de taille irrégulière.

L'AQUIOS CL peut être utilisé en toute sécurité par des personnes non expertes en cytométrie en flux, ce qui permet d'affecter les ressources en personnel de manière à maximiser la productivité.

Mécanismes de contrôle qualité

Réactifs à code-barres. Les réactifs AQUIOS utilisent un code-barres d'identification unique pour le suivi de la date d'expiration, de la durée d'utilisation, du lot et des numéros de récipients. La consommation de réactifs et l'utilisation des plaques sont surveillées par le système au fur et à mesure du traitement des échantillons. Le lecteur de code-barres scanne un réactif ou une plaque lors de sa première utilisation, ce qui garantit que les informations sur les consommables sont exemptes d'erreurs. Le système de suivi intelligent des réactifs AQUIOS assure un suivi en temps réel des consommables qui garantit l'utilisation de réactifs correctement datés et la présence d'une quantité suffisante de réactifs pour chaque échantillon, ce qui élimine le risque de devoir réanalyser des échantillons en cas de niveaux de réactifs insuffisants. Le système n'exécutera pas un test s'il ne trouve pas les flacons d'anticorps nécessaires.

Codes-barres d'échantillons et identification positive des échantillons. Le lecteur de codes-barres de tubes AQUIOS CL peut lire automatiquement les codes-barres d'échantillons sans l'aide d'un lecteur de codes-barres portatif. Le cytomètre en flux AQUIOS CL fait correspondre le code-barres du tube à la demande du SIL. L'ID échantillon est enregistré immédiatement avant l'aspiration de l'échantillon pour éviter toute erreur d'identification ; un suivi automatique de l'ID échantillon a lieu tout au long de l'analyse.

Contrôles de processus. Les cellules de contrôle AQUIOS STEM CD34 sont des préparations liquides de leucocytes humains stabilisés destinées à la vérification des paramètres CD34 et CD45 sur le système AQUIOS STEM. Chaque kit contient deux niveaux de cellules CD34 comprenant approximativement 10 cellules CD34+/µL pour le niveau 1 et 30 cellules CD34+/µL pour le niveau 2. Les valeurs d'analyse sont entrées dans le système via la lecture du code-barres de la fiche d'analyse des cellules de contrôle.

Le module de contrôle qualité du logiciel AQUIOS STEM permet l'accès à eIQAP, le programme électronique d'assurance qualité interlaboratoire de Beckman Coulter, qui permet aux utilisateurs d'obtenir des rapports de comparaison entre groupes de pairs à intégrer aux données de contrôle qualité de leur laboratoire.

Mise en pause automatique en cas d'échec de CQ. Le cytomètre en flux AQUIOS CL a été conçu en tant qu'instrument « Load and Go ». Il est doté de fonctions de mise en pause automatique que l'utilisateur peut activer pour passer automatiquement aux échantillons patient une fois que le CQ a été effectué avec succès. Si cette fonction est activée et que le CQ échoue, l'instrument ne traite pas les échantillons patient et l'utilisateur peut être automatiquement alerté.

Vérifications du système. Le système contrôle automatiquement la puissance du laser et vérifie que le vide est acceptable avant l'analyse de chaque échantillon. Le système vérifie également les communications internes et le bon fonctionnement du matériel à chaque étape du processus. En outre, le système effectue une vérification fluidique au début de chaque analyse pour s'assurer que la quantité de liquide de gainage AQUIOS est suffisante pour l'analyse demandée.

Options de rapport avancées

Afin de faciliter l'application des normes et exigences de contrôle qualité internes et externes, le logiciel AQUIOS STEM rapporte plusieurs paramètres statistiques qui vont au-delà des rapports traditionnels de cytométrie en flux pour la quantification des CD34+ (tableau 1). Veuillez consulter le bulletin d'application « Conformité du système AQUIOS STEM aux recommandations internationales de numération clinique des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34+ » pour une liste complète des fonctionnalités.

Tableau 1 Statistiques et paramètres de population sélectionnés du système AQUIOS STEM allant au-delà des rapports traditionnels de cytométrie en flux pour la quantification des CD34+ et permettant de respecter les normes et exigences de contrôle qualité internes et externes.

Composants du système AQUIOS STEM et paramètres du système

Le système AQUIOS STEM offre une approche modulaire de l'analyse automatisée des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34+ sur le cytomètre en flux AQUIOS CL. La solution, constituée des composants spécifiés au tableau 2, est destinée à être utilisée par les professionnels de laboratoire pour la détection des paramètres des types d'échantillons indiqués au tableau 3 sur le cytomètre en flux automatisé AQUIOS CL.

Tableau 2 Statistiques et paramètres de population sélectionnés du système AQUIOS STEM allant au-delà des rapports traditionnels de cytométrie en flux pour la quantification des CD34+ et permettant de respecter les normes et exigences de contrôle qualité internes et externes.

Tableau 3 Paramètres du système AQUIOS STEM

Références

1. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I: The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996 Jun;5(3):213-26.
2. Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):61-70.
3. EDQM Council of Europe: European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). 10th Edition 2019-2022. Website: https://pheur.edqm.eu/home
4. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT): NetCord-FACT international standards for cord blood collection, banking, and release for administration. 7^th Edition, 2019. Website: http://www.factwebsite.org/
5. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT) - Joint Accreditation Committee (JACIE): FACT-JACIE International standards for hematopoietic cellular therapy product collection, processing, and administration. 8^th Edition, 2021. Website: http://www.factwebsite.org/
6. Dorn-Beineke A, Sack U: Quality control and validation in flow cytometry. J Lab Med 2016; 40 s1:1-13.
7. Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D: ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82B:9-17.