Procédés de culture anaérobie des bactéries probiotiques dans le microbioréacteur BioLector XT



Introduction

anaerobic cultivation biolector xtLes probiotiques sont des bactéries vivantes qui sont supposés avoir des eff ets bénéfi ques sur la santé et sur la fonction biologique de l'organisme humain. Ils sont couramment utilisés pour accroître le nombre de bactéries désirables dans l'intestin et pour régénérer la flore intestinale, par exemple après des traitements antibiotiques. C'est l'une des raisons pour lesquelles le marché des probiotiques ou des compléments alimentaires probiotiques a pris énormément de valeur1. Le domaine de recherche du microbiome intestinal humain et ses bienfaits pour la santé
sont particulièrement importants pour l'industrie alimentaire. Par conséquent, la recherche scientifi que sur les techniques de cultures microaérophiles ou anaérobies, telle que la culture de probiotiques dans des conditions semblables au microbiome, revêt un caractère essentiel. Les probiotiques incluent une gamme complète de bactéries anaérobies dont les Lactobacillus ou Bifidobacterium. Parmi les diff érentes bactéries probiotiques, le Bifidobacterium spp. est l'une des espèces de bactéries probiotiques les plus couramment utilisées et étudiées. Il est classé parmi les bactéries anaérobies strictes en raison de son incapacité à respirer de l'oxygène et de sa croissance dans des conditions de culture anaérobie2. C'est aussi un membre majeur du microbiote intestinal humain3.

Il joue un rôle important en matière de contrôle du pH grâce à la libération d'acides lactiques et acétiques, qui limitent la croissance de nombreuses bactéries potentiellement pathogènes4. Dans le tube digestif des nourrissons allaités, le Bifi dobacterium représente l'espèce de cellules prédominante. Il constitue plus de 80 % des microorganismes dans l'intestin1, 5. On dénombre plus de 200 espèces connues de Lactobacillus. Il s'agit du genre le plus répandu et le plus divers parmi les bactéries lactiques, généralement reconnu comme sûr (GRAS) par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis. Le Lactobacillus spp. a été largement utilisé et a fait l'objet de nombreuses études en tant que culture permettant d'activer la fermentation pour les produits laitiers ou les probiotiques en raison de son potentiel appliqué pour la santé6.

Dans cette note d'application, nous présentons des expériences de cultures anaérobies à l'aide du microbioréacteur BioLector XT en combinaison avec le couvercle de gazéification. Lemicrobioréacteur BioLector XT est un dispositif de paillasse pour la sélection à haut débit des cultures microbiennes qui permet le suivi en ligne des paramètres de culture les plus courants tels que la biomasse, la valeur pH, la saturation en oxygène de phase liquide (DO) et l'intensité de fluorescence de différentes molécules ou protéines fluorescentes. Pour obtenir un haut débit, les cultures sont eff ectuées dans des plaques microtitre de format standard SBS/SLAS de 48 puits chacune, ce qui permet d'analyser simultanément jusqu'à 48 batch dans un seul système de microbioréacteur BioLector XT. Nous montrons également la simplicité d'utilisation du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT (figure 1) pour eff ectuer des cultures anaérobies en batch et fed-batch de bactéries probiotiques Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum et Bifidobacterium bifidum. Un avantage considérable du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT réside dans le fait que l'alimentation et le contrôle pH peuvent désormais avoir lieu simultanément lors de la gazéifi cation directe à l'azote (par exemple, 100 % N2) de la plaque microtitre (MTP) avec des débits ajustables compris entre 5 et 50 mL/min.

bioLector XT microbioreactor gassing Id for microfluidic MTPs

Figure 1. The BioLector XT microbioreactor gassing Id for microfluidic MTPs

Figure 1. Couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT pour les MTP microfluidiques

Méthodes

Cultures anaérobies de souches Lactobacillus

Toutes les cultures de Lactobacillus spp. (Lactobacillus casei DSM 20011 ou Lactobacillus plantarum DSM 20174) ont eu lieu dans du bouillon MRS (Carl Roth, Allemagne) à une température ambiante de 37 °C dans des conditions anaérobies. Le bouillon MRS a été enrichi avec 0,5 g/L de cystéine HCl qui fonctionne comme agent réducteur pour le potentiel d'oxydo-réduction en réduisant l'O2 moléculaire résiduel dans le milieu. Toutes les précultures ont été réalisées dans une fi ole Erlenmeyer de 250 mL. À cette fi n, 20 mL de bouillon MRS préparé ont été inoculés avec 1 mL de cryoculture, puis cultivés pendant au moins 24 heures dans des conditions anaérobies. La principale culture a ensuite été défi nie sur DOdépart = 1 dans le bouillon MRS. Les cultures suivantes du microbioréacteur BioLector ont été eff ectuées dans une plaque microfl uidique à puits ronds de nouvelle génération pour les cultures en batch et fed-batch avec contrôle pH. Les cultures ont été menées à 37 °C, 600 tr/min et en activant le contrôle d'humidité. Les volumes de départ des puits de culture ont été définis sur 2 000 μL et les volumes maximaux sur 2 400 μL. Le suivi en ligne de la biomasse (gain 3), ainsi que la mesure du pH (LG1) et de l'oxygène dissous (RF) ont été eff ectués à l'aide du microbioréacteur BioLector XT. Un aperçu détaillé des conditions de culture en fed-batch de L. casei est présenté dans le tableau 1.

Contenu Paramètres microfluidiques
Réservoir A (alimentation) 500 g/L glucose
  • Volume de pompage : 0,16 μL
  • Volume de remplissage : 1 900 μL
  • Début de l'alimentation : > 7,5 h ou > 10 h
  • Alimentation constante : 4 μL/h
Réservoir B (contrôle pH) 3 M NaOH
  • Volume de pompage : 0,30 μL
  • Volume de remplissage : 1 900 μL
  • Début du contrôle pH : > 0,5 h
  • Paramètres correcteur PID : MOYEN
Puits de culture L. casei dans bouillon MRS
  • Volume de départ : 2000 μL
  • Volume max. : 2400 μL
  • Contrôle pH : pH 6,0

Table 1. Fed-batch cultivation conditions for L. casei

Cultures anaérobies de B. bifidum dans le microbioréacteur BioLector XT

Toutes les cultures de Bifidobacterium bifidum (SinoPlaSan AG, Allemagne) ont été réalisées dans un bouillon MRS (Carl Roth, Allemagne) à 37 °C et dans des conditions anaérobies. Le bouillon MRS a été enrichi avec 0,5 g/L de cystéine HCl qui fonctionne comme agent réducteur pour le potentiel d'oxydo-réduction en réduisant l'O2 moléculaire résiduel dans le milieu. Toutes les cultures de précultures ont été réalisées dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL. À cette fin, 20 mL de bouillon MRS ont été inoculés avec le contenu d'une capsule puis cultivés pendant au moins 24 h à 37 °C dans des conditions anaérobies. La principale culture a été définie sur DOdépart = 1,0 dans le bouillon MRS.

Pour la principale culture, des cultures en batch et fed-batch ont été eff ectuées dans les microbioréacteurs BioLector XT avec contrôle pH à 37°C, 600 tr/min, en activant le contrôle d'humidité, le suivi en ligne de la biomasse (gain 3), le pH (LG1), et l'oxygène dissous (RF). Un aperçu détaillé des conditions de culture en fed-batch de B. bifidum est présenté dans le tableau 2.

Contenu Paramètres microfl uidiques
Réservoir A (alimentation) 500 g/L glucose
  • Volume de pompage : 0,16 μL
  • Volume de remplissage : 1 900 μL
  • Début de l'alimentation : > 5 h
  • Alimentation constante : 4 μL/h
Réservoir B (contrôle pH) 3 M NaOH
  •  Volume de pompage : 0,30 μL
  • Volume de remplissage : 1 900 μL
  • Début du contrôle pH : > 0,5 h
  • Paramètres correcteur PID : MOYEN
Puits de culture B. bifidum dans bouillon MRS
  • Volume de départ : 2000 μL
  • Volume max. : 2400 μL
  • Contrôle pH : pH 6,0

Tableau 2. Conditions de culture en fed-batch pour B. bifidum

Paramètres de disposition dans la plaque microfluidique à puits ronds de nouvelle génération

Toutes les cultures en fed-batch ont eu lieu dans la plaque microfluidique à puits ronds de nouvelle génération (figure 2).

Schematic illustration of the NextGen-Microfluidic Round Well Plate

Figure 2. Schematic illustration of the NextGen-Microfluidic Round Well Plate

Figure 2. Illustration schématique de la plaque microfluidique à puits ronds de nouvelle génération

La ligne A contient 1 900 μL de solution d'alimentation en glucose et la ligne B a été remplie avec 1 900 μL d'agent d'ajustement de pH. Dans le logiciel BioLector, les volumes de pompage ont été
ajustés à 0,30 μL pour les solutions aqueuses (3 M NaOH) et à 0,16 μL pour la solution d'alimentation plus visqueuse (500 g/L de glucose). Dans toutes les expériences en fed-batch, l'alimentation a été déclenchée par une fonction temporelle et le profi l d'alimentation a été défi ni sur une alimentation constante avec 4 μL/h. Le contrôle pH a été défini sur un pH de 6,0. Les conditions anaérobies lors de toutes les cultures dans les plaques microfluidiques à puits ronds de nouvelle génération ont été obtenues à l'aide du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT, qui a été fi xé à la MTP après avoir été préparé et scellé au moyen d'un film en silicone stérile perméable au gaz (F-GPRSMF32-1).

Résultats

Culture en fed-batch de Lactobacillus casei dans le microbioréacteur BioLector XT

La figure 3 présente le procédé de culture de Lactobacillus casei dans le bouillon MRS. Le graphique supérieur présente les signaux en ligne de biomasse, le signal d'oxygène dissous (DO) et le volume de solution d'alimentation ajoutée (500 g/L de glucose). Dans le graphique inférieur, les valeurs en ligne de pH et les volumes associés de NaOH sont représentés par rapport à la durée de culture.

Cultivation of L. casei

Figure 3. Cultivation of L. casei using the gassing lid in the BioLector XT microbioreactor

Figure 3. Culture de L. casei à l'aide du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT.

Dans ce graphique, les différentes configurations de procédés ont été appliquées : une culture en batch et deux cultures en fed-batch. L'une dont l'alimentation débute après 7,5 heures et l'autre dont l'alimentation débute après 10 heures. Avec un débit continu de 30 mL/min N2, le DO diminue de manière constante. Après 45 minutes, un DO inférieur à 5 % a été atteint et continue de diminuer. Après 4,5 heures, le DO est dépassé en dessous de 0,5 % et continue de baisser en direction de 0 %. Avec l'initiation d'une phase stationnaire de culture à environ 6,7 heures, la croissance exponentielle s'arrête et le signal de biomasse qui était de 42 u.a. dans les trois cultures approche à cet instant. La culture en batch continue d'augmenter lentement vers un maximum de 44 u.a. à 9,5 heures puis elle diminue vers un signal de biomasse fi nal de 38 u.a. au terme de la culture. Une augmentation du signal de biomasse est corrélée avec l'ajout de la solution d'alimentation. Dès le début de l'alimentation, une augmentation du signal de la biomasse est visible. Le signal de biomasse final pour le procédé en fed-batch de 7,5 h était de 76,3 u.a. et pour le procédé en fed-batch, il a abouti à un signal de biomasse fi nal de 65,5 u.a. après 30 heures. Les valeurs pour la solution de base ajoutée sont liées à la croissance. L'ajout de 3 M NaOH a été arrêté
lors de l'initiation de la phase stationnaire car aucune autre production d'acide bactérienne n'a eu lieu du fait de l'absence de croissance. Dans le cas de l'ajout constant de solution d'alimentation, la production d'acide a continué et, par conséquent, une base s'est avérée nécessaire pour maintenir la valeur de consigne de pH à pH 6,0.

En résumé, l'expérience montre que le microbioréacteur BioLector XT est un dispositif adapté aux cultures anaérobies en raison du couvercle de gazéification et de l'application réussie du contrôle pH et de l'alimentation en simultané avec une gazéifi cation anaérobie directe.

Validations technique et biologique des conditions anaérobies dans le microbioréacteur BioLector XT

Le maintien de conditions anaérobies pendant toute la durée de culture est une exigence importante dans le cadre de la culture d'organismes sensibles à l'oxygène. Dans l'expérience suivante, un capteur d'oxygène externe (capteur FTM Pst6/Fibox 4 trace, PreSens Precision Sensing GmbH, Allemagne) a été installé au niveau de la sortie de gaz du microbioréacteur BioLector XT pour valider la fonctionnalité technique du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT et pour prouver l'étanchéité du couvercle de gazéifi cation et, par conséquent, de l'atmosphère anaérobie.

La figure 4 présente les données expérimentales d'une culture en batch de Lactobacillus plantarum (L. plantarum). Le graphique supérieur affi che le signal de biomasse en ligne (gain 3) et le graphique inférieur affi che le signal en ligne d'oxygène dissous dans le bouillon de culture et la concentration d'oxygène dans la sortie de gaz du microbioréacteur BioLector XT, le signal de pH en ligne ainsi que le volume NaOH ajouté pour le contrôle pH.

Après un temps de latence de 2,86 heures, la croissance exponentielle a démarré. Le signal de biomasse final était de 155,865 u.a. (DO600 = 9,01 ± 0,07) après 7,96 heures lorsque la phase stationnaire a été initiée. Lors de la croissance de L. plantarum, la production d'acide lactique a eu lieu. La croissance de la formation d'acide est corrélée au volume de NaOH ajouté pour maintenir le pH 6. Avec un débit continu de 30 mL/min N2, le DO diminue de manière constante. Après 39 minutes, un DO inférieur à 5 % a été atteint et continue de diminuer. Après 4 heures, le DO a chuté de nouveau en dessous de 0,5 % et a continué de baisser en direction de 0 %. Le capteur externe affichait une concentration d'oxygène finale de 0,029 % après une durée de culture de 16 heures.

. Cultivation of L. plantarum using the gassing lid

Figure 4. Cultivation of L. plantarum using the gassing lid in the BioLector XT microbioreactor in biological duplicates.

Figure 4. Culture de L. plantarum à l'aide du couvercle de gazéification du microbioréacteur BioLector XT dans des réplicats biologiques.

Grâce à cet exemple de culture, la fonctionnalité technique a été validée, mais la capacité du Lactobacillus spp. à croître dans des conditions anaérobies et même à métaboliser l'oxygène ne constitue pas une preuve suffi sante pour la validation biologique de la culture anaérobie dans le microbioréacteur BioLector XT. Ainsi, le Bifidobacterium bifidum anaérobie strict a été cultivé. La culture réussie de cette souche permet la validation biologique des cultures anaérobies dans le microbioréacteur BioLector XT. La figure 5 présente les données expérimentales d'une batch ainsi que la culture en fed-batch du B. bifidum. Dans le graphique supérieur, les signaux en ligne de biomasse et le volume d'alimentation ajouté sont représentés par rapport à la durée de culture. Le graphique inférieur présente le signal en ligne (optodes) de pH et de DO, ainsi que le volume ajouté de 3 M NaOH et le signal d'oxygène du capteur de gaz externe dans la sortie de gaz du microbioréacteur.

Cultivation of B. bifidum using the gassing lid

Figure 5. Cultivation of B. bifidum using the gassing lid in the BioLector XT microbioreactor in biological duplicates.

Figure 5. Culture de B. bifidum à l'aide du couvercle de gazéifi cation du microbioréacteur BioLector XT dans des réplicats biologiques.

Après un temps de latence de 2,4 heures, la croissance exponentielle a démarré et pour la culture en batch, le signal de biomasse a atteint une valeur finale de 147,57 u.a. (DO600 = 8,3 ± 0,57). En comparaison avec la culture en batch, une phase de croissance exponentielle étendue est observable dans la culture en fed-batch. Ce phénomène est causé par une quantité supérieure de glucose dans le milieu lorsque l'alimentation a déjà démarré après 6 heures. Après 23 heures de culture, une valeur de biomasse maximale de 227,3 u.a. (DO600 = 15,93 ± 0,69) a été obtenue. Lors de la croissance de B. bifidum, la production d'acide lactique a eu lieu et sa croissance est corrélée, ce qui est observable dans la courbe d'ajout de NaOH pour maintenir le pH à pH 6. Au total, 193,56 μL de 3 M NaOH ont été pompés dans le bouillon de culture. Avec un débit continu de 30 mL/min N2, le DO diminue de manière constante. Les données d'oxygène externes déjà décrites pendant les 16 premières heures depuis la culture de L. plantarum (comme décrit précédemment) et de B. bifidum ont été collectées simultanément au cours de la même analyse et, par conséquent, les même MTP, couvercle de gazéification et capteur de gaz externe ont été utilisés. On peut observer que le signal de DO augmente légèrement à partir de 18 heures, ce qui peut être expliqué par l'écart de signal conditionné techniquement des optodes d'oxygène avec un écart à 0% d'oxygène de < 0,5 % d'O2 par jour. Les données du capteur d'oxygène externe ont montré une valeur de 0,029 % d'oxygène dans la sortie de gaz du microbioréacteur BioLector XT après 23 heures, confirmant que les conditions de cultures anaérobies ont été maintenues pendant toute la durée de culture.

En conclusion, nous présentons une expérience de culture menée avec succès d'un organisme anaérobie dans le microbioréacteur BioLector XT. En combinaison avec la technologie de puce microfluidique m2p-labs et la gazéification directe à l'azote à l'aide du couvercle de gazéification, les performances simultanées du contrôle pH, de l'alimentation et de la gazéification directe à l'azote ne représentent plus un obstacle dans le cadre de cultures à petite échelle.

Conclusion

Pour résumer, nous présentons les validations technique et biologique de la culture de probiotiques tels que le Lactobacillus spp. et le Bifidobacterium bifidum dans le microbioréacteur BioLector XT en combinaison avec son couvercle de gazéification anaérobie. La technologie de puce microfluidique m2p-labs combinée à la gazéification directe à l'azote à l'aide du couvercle de gazéification permet les performances simultanées du contrôle pH, de l'alimentation et de la gazéification directe à l'azote à l'aide de systèmes de cultures à petite échelle. Il s'agit d'un système adapté à la culture de bactéries anaérobies.

Références

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