7 Conseils pour concevoir vos panels multi couleurs pour la cytométrie en flux

Grâce à des panels bien conçus et à des réactifs de haute qualité, la cytométrie en flux multi couleurs est un outil puissant pour détecter et surveiller simultanément plusieurs paramètres de votre échantillon. Cependant, la qualité des données dépend fortement d'une conception de panel optimisée et d'un instrument correctement réglé. Les 7 principes suivants vous aideront à éviter les pièges courants de la cytométrie en flux multi couleurs et à améliorer ainsi la qualité de vos résultats.

1. Sélection du fluorochrome

Tous les colorants n’ont pas les mêmes caractéristiques. Certains sont extrêmement brillants, tandis que d'autres sont comparativement pâles. Cependant, choisir le colorant le plus brillant n'est pas toujours la meilleure idée et éviter un colorant pâle n'est pas toujours recommandé. En général, il est conseillé d'utiliser un colorant suffisamment brillant pour détecter l'antigène d'intérêt tout en provoquant le moins de fuites possibles dans les autres détecteurs. Les fuites se produisent lorsque le signal d'un fluorochrome est repéré par un détecteur réglé pour mesurer l'émission d'un autre fluorochrome, contribuant ainsi à un signal indésirable dans le canal de cet autre colorant. Une émission plus brillante signifie plus de potentiel de débordement, ce qui peut entraîner une perte de résolution. Pour éviter cela, utilisez les colorants les plus brillants pour les antigènes faiblement exprimés et inversement, utilisez des colorants faibles pour les antigènes fortement exprimés. Le respect de cette règle vous permettra de démocratiser vos colorants!



2. Sélection du canal

Voyons les choses en face, des fuites peuvent se produire, mais vous pouvez toujours optimiser votre sélection de colorants pour votre panel - Choisissez des fluorochromes ayant une influence réduite sur les autres canaux pour les antigènes fortement exprimés (colonnes vertes), tout en attribuant aux antigènes faiblement exprimés des fluorochromes dont le canal de détection est légèrement impacté par les retombées d’autres fluorochromes (rangées jaunes). Le choix des attributions indiqués ci-dessus dépend de la configuration de l'instrument et des fluorochromes concernés. Assurez-vous de tester les combinaisons de fluorochromes et de canaux pour trouver la meilleure composition pour votre panel. Il peut être difficile d'éviter les débordements lors de la conception de panels utilisant tous les canaux disponibles, mais ces conseils peuvent vous aider à réduire leur impact sur les résultats.



3. Exclusion d'antigène

A quoi correspond une légère fuite entre antigènes mutuellement exclusifs? Les fuites entre les spectres d’émission de deux antigènes n’interféreront pas avec votre panel si les antigènes ne sont pas exprimés ensemble sur les mêmes cellules de la fenêtre de sélection des cellules d’intérêt.



4. Co-expression de l'antigène

Si un marqueur a généralement ou potentiellement une densité d’expression variable ou faible, vous devez essayer de réduire les fuites des marqueurs des antigènes co-exprimés dans le canal de ce marqueur, car le débordement peut recouvrir des données et masquer des modulations éventuelles. Seuls les fuites des marqueurs conjugués d’antigènes non co-exprimés sont sans risque et n’affecteront pas la sensibilité ni la résolution des antigènes modulés ou faiblement exprimés.




5. Parent-descendant

Pour les panels de cytométrie en flux multi couleurs, vous pouvez autoriser un marqueur de sous-ensemble ou de sous-population (descendant) à déborder sur le marqueur de sélection de population (parent). Le marqueur parent tolérera cette fuite puisque le descendant sera toujours positif pour le marqueur parent. Par exemple, si CD4 montre une forte fuite dans le canal CD3 à l'intérieur d'une fenêtre de lymphocyte, la diffusion du bruit de fond n'entraînera pas de bruit de fond dans le canal CD3 car les cellules T CD4 + sont également CD3 +. Faites attention aux conditions inverses, où le marqueur parent déborde avec le marqueur descendant, car la fuite du signal parent contaminera le bruit de fond du signal descendant.



6. Seuil positif

Les fuites sur un antigène co-exprimé sont acceptables si l'objectif est uniquement d'identifier les cellules très positives ou de faire la distinction entre l'expression brillante et l'expression moyennement forte / faible. Toutefois, les fuites ne sont plus acceptables dès lors que l'objectif est de distinguer les expressions faibles des expressions négatives, car cela nuirait à vos données et donc à vos résultats en entraînant des faux positifs.



7. Complexité des débordements

Dites adieu à la complexité et essayez de garder les schémas des fuites aussi simples et évidents que possible pour éviter les limites de détection dépendant du phénotype. N'oubliez pas, cependant, que les fluorochromes généreront des fuites et des bruits de fond qui n’apparaitront pas dans votre diagramme en points. Par conséquent, "rester simple" peut être finalement assez compliqué!
 




Gardez ces 7 conseils à l'esprit lors de la planification de votre prochain phénotype multi couleurs en cytométrie en flux. Il en résultera une détection de signal optimale et une fiabilité accrue des résultats avec une complexité réduite. Pour améliorer encore vos chances de succès avec la cytométrie en flux multi couleurs, utilisez des réactifs de haute qualité et robustes ayant fait l'objet d'un examen minutieux.

Plus vos réactifs sont fiables, plus vos données le deviennent!
 

 

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