Décryptage d’une maladie à l’aide de biomarqueurs exosomes

Les exosomes sont de petites vésicules circulantes (< 150 nm) liées à des membranes, coincées par endocytose dans les membranes des cellules et libérées par exocytose à la suite de la fusion membranaire des corps multivésiculaires1. En dépit de leur taille réduite, les exosomes contiennent de nombreuses informations sur la santé des cellules et des organes d’origine, ce qui les rend parfaitement adaptés comme biomarqueurs de maladie pour des applications diagnostiques. Lors de la formation des exosomes, ils encapsulent un petit échantillon de composants cellulaires clés, comme la membrane plasmique (dont les protéines de surface), le cytosol, l’acide désoxyribonucléique (ADN), l’acide ribonucléique (ARN) (dont l’ARN messager [ARNm) et le micro-ARN) et les protéines. L’isolement des exosomes et l’analyse de leurs constituants peuvent révéler des modifications communes aux états pathologiques, ce qui permet une détection précoce et un diagnostic moins invasif.

Des méthodes minimalement invasives sont déjà utilisées pour la caractérisation et le diagnostic de maladies pour lesquelles l’accessibilité aux échantillons n’est pas limitée, comme les cancers du sang et les affections cutanées. Mais les biomarqueurs exosomes constituent un outil essentiel pour le développement de méthodes minimalement invasives pour l’étude de l’évolution des maladies qui touchent des organes plus délicats et pour lesquels il est plus difficile d’obtenir un échantillon, comme le cerveau et la moelle épinière2-5, les reins,6-8 et le cœur et les vaisseaux9, 10

Source d’exosomes

Les exosomes peuvent être isolés de pratiquement tous les fluides corporels, mais pour un diagnostic optimal ou une valeur pronostique, il est préférable de sélectionner un fluide en contact direct avec le ou les organes d’intérêt. Pour analyser le statut d’une maladie dans l’ensemble de l’organisme, le sang est un premier choix cohérent, car c’est le fluide qui est au contact de tous les systèmes d’organes. Parmi les autres fluides biologiques que l’on a pu étudier pour déterminer leur teneur en exosomes, on distingue le liquide amniotique11, le lait maternel12, la salive11, les larmes13 et l’urine14, 15. Ces «biopsies des fluides», un terme utilisé à l’origine dans la littérature scientifique en 197416, permettent une surveillance non invasive du fonctionnement d’un système d’organes par le biais de la composition des fluides les entourant, dont leur contenu en exosomes. 

La pureté des préparations d’exosomes est primordiale pour des analyses fiables et reproductibles. Ainsi, une attention particulière doit être portée à la préservation de la pureté des fluides contenant des exosomes. Lors du prélèvement de l’échantillon de fluide, veillez à ne pas le contaminer accidentellement avec d’autres fluides biologiques. Cette forme de contamination est moins préoccupante lorsqu’il s’agit de prélèvement de sang, avec le sang comme fluide cible. Mais lorsque le prélèvement de fluide intervient dans d’autres compartiments, comme l’espace sous-arachnoïdien de la colonne vertébrale ou de l’articulation synoviale, des précautions spéciales spécifiques au genou doivent être prises pour éviter de contaminer l’échantillon par le sang provenant de la piqûre d’aiguille. Même lors d’une procédure non invasive de prélèvement de fluide, par exemple, lors du prélèvement d’urine de miction propre, les bonnes pratiques doivent être respectées pour éviter de contaminer l’échantillon.

Isolement des exosomes

Actuellement, différentes méthodes utilisées couramment permettent d’isoler les exosomes de biopsies des fluides, comme l’ultracentrifugation différentielle, la centrifugation à gradient de densité, la microfiltration, les billes magnétiques recouvertes d’anticorps et les dispositifs microfluidiques, sachant que l’ultracentrifugation différentielle est considérée comme la norme de référence.17 L’ultracentrifugation différentielle étant la méthode la plus répandue pour l’isolement des exosomes, vous devez tenir compte de l’importance d’utiliser un protocole approprié avec le rotor adéquat dans le but d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats.18

Comparaison des méthodes d’isolement des exosomes (adapté de 17) 

 

Dispositifs microfluidiques

Méthode d’isolement Avantages Inconvénients
Ultracentrifugation différentielle Méthode de référence standard, adaptable facilement pour prendre en compte la viscosité Durées de rotation longues, impossible de séparer les virus des exosomes, protéines de coprécipitation
Centrifugation à gradient de densité Moins de coprécipitation indésirable, les méthodes spécialisées permettent de séparer les virus Précipitation non spécifique d’espèces de même taille
Microfiltration Amélioration de la vitesse Interaction matrice/membrane, copurification de protéines, récupération suboptimale
Billes magnétiques recouvertes d’anticorps Isolement très spécifique d’une population d’exosomes Non adapté aux grands volumes d’échantillons, l’élution des exosomes sur des billes peut les altérer

Coût inférieur, moins d’échantillons nécessaires

Efficacités variables selon les différents protocoles disponibles

Quelle que soit la méthode d’isolement d’exosomes choisie, il existe des règles de l’art en matière d’isolement des exosomes, dans le sens où le plus n’est pas forcément le mieux et le meilleur guide est un bon jugement et l’expérience préalable. L’utilisation de seuils de taille ou d’exigences d’antigénicité trop strictes peut être tout aussi néfaste que l’utilisation de seuils de taille ou d’exigences d’antigénicité trop larges. Le principal élément à garer à l’esprit est que la pureté et l’intégrité de l’échantillon constituent la plus haute priorité. La conservation d’un échantillon d’exosomes purs implique d’être vigilant à tous les stades de la procédure d’isolement des exosomes afin de prévenir la perte de l’échantillon et de préserver la fiabilité des données.

Comme c’est le cas avec toute structure liée à la membrane, des exosomes à la cellule animale, une manipulation brutale ou inappropriée peut entraîner la lyse, et la lyse involontaire des exosomes avant que vous soyez prêt est le meilleur moyen de perdre des échantillons. Aussi, soyez attentif lors de l’exécution de chaque étape du protocole à la température recommandée et avec le tampon recommandé, tout en maintenant l’échantillon à distance des détergents et des métalloprotéases matricielles.

Une mauvaise manipulation des échantillons, en particulier lors des lavages, peut entraîner la perte totale de l’échantillon. Marquez toujours les tubes de manière à mentionner l’étape spécifique du protocole. Cela peut permettre d’éviter d’éliminer un surnageant contenant des exosomes de valeur ou de supprimer un tube contenant un extrait important. C’est l’erreur la plus courante faite dans tout protocole comportant des étapes variables, qui incluent des lavages et des surnageants. Une personne avertie en vaut deux: il est donc essentiel d’agir avec mesure, conscience et méthode. 

Profilage des maladies avec des exosomes

Pour diagnostiquer ou suivre la progression d’une maladie à l’aide de biomarqueurs exosomes, vous devez d’abord développer une référence de profil exosomal sain ou non malade. Cela peut impliquer une étude de la population afin d’évaluer les variations possibles d’un profil sain, une étude longitudinale du profil exosomal d’un patient unique, avant et après l’apparition de la maladie (nécessitant une extrême patience ou une coïncidence fortuite) ou, et cette option intéressera ceux qui n’ont pas un accès illimité à un flux de patients sans aversion pour les aiguilles, une comparaison entre les exosomes produits par une lignée cellulaire «normale» et une lignée cellulaire «malade».

Un des contenus d’exosomes le plus courant, utilisé pour le diagnostic et le pronostic d’une maladie est le micro-ARN (miARN), dont la présence ou l’absence peut être utilisée comme biomarqueur de prédiction direct du risque19, de survenue20, de progression21 ou de rémission22 d’une maladie. L’isolement des micro-ARN de fractions exosomales a été normalisé23 et est aujourd’hui l’une des méthodes couramment utilisées pour l’enrichissement de micro-ARN spécifiques d’une maladie dans l’organisme ou dans un système d’organes spécifique. 

Le décryptage des états pathologiques grâce à des biomarqueurs exosomes, que ce soit dans une lignée cellulaire ou dans une population humaine, est une technique solide, qui apporte un éclairage sur la valeur prédictive majeure de ces messagers circulants, écartés dernièrement en tant qu’éléments d’élimination de déchet conditionnés. Il reste clairement encore beaucoup à faire au niveau de ces minuscules messagers. Pour plus d’informations sur l’isolement des exosomes, les biopsies des fluides et les biomarqueurs de maladie, [lien vers la page sur beckman.com à déterminer].

Références

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