Développement et production de vecteurs viraux : Un élan vers l’avenir de la thérapie génique

La production de vecteurs viraux avec le Dr Johannes van der Loo

Dr. Johannes van der Loo

Depuis près de 40 ans, il semble que la promesse de la thérapie génique ait fait des progrès et des reculs à plusieurs reprises.

Merci aux scientifiques tels que le Dr Johannes (Han) van der Loo, qui sont prêts pour le changement.

Considéré comme un pionnier dans le développement de modèles de production pour les vecteurs viraux, le Dr van der Loo pense que la thérapie génique ne connaitra que des progrès au cours des années à venir. Et il n’est pas seul.

La taille du marché de la thérapie génique du cancer était estimée à 805,5 millions de dollars américains en 2015, avec un taux de croissance annuel composé qui devrait dépasser 20 % d’ici 2024.1  Les experts prévoient un marché de la thérapie génique en 2025 évalué à 11 milliards de dollars.2

C’est une croissance impressionnante pour un domaine de recherche qui, à ce jour, n’a produit que cinq thérapies dont l’utilisation a été approuvée - dont une seule a été commercialisée en dehors de l’Asie (et seulement dans l’UE).2

Le Dr van der Loo, cependant, souligne que les nouvelles thérapies géniques sont à un stade avancé de développement, et que d’autres sont en cours dans le monde entier.

Et c’est une impulsion vers l’avant pour la thérapie génique qui continuera à mener d’importantes recherches sur le développement de vecteurs viraux sûrs pour la fourniture de traitements qui sauveront des vies à l’avenir.

Catégories et types de vecteurs viraux

Le Dr van der Loo explique que les vecteurs de thérapie génique se répartissent en trois catégories de base :

1. Vecteurs viraux intégrateurs (p. ex. gammaretrovirus et lentivirus), qui s’intègrent dans le génome de la cellule cible et sont donc répliqués dans les cellules filles après la mitose.

2. Vecteurs viraux non intégrateurs (p. ex. adénovirus et virus adéno-associé), qui restent épisomiques, réduisant ainsi le potentiel d’oncogenèse.

3. Vecteurs non viraux, tels que l’ADN plasmatique. 

D’autres types courants de vecteurs viraux comprennent l’alphavirus, le virus de l’herpès et la vaccine.

Lors du choix d’un vecteur viral, selon le Dr van der Loo, il est d’abord important de décider si vous avez besoin d’un vecteur intégrateur ou non intégrateur.

« Si la cible, par exemple, est une cellule souche hématopoïétique qui doit se diviser et donner naissance à une progéniture importante », explique-t-il, « le vecteur viral intégrateur est le meilleur choix car le gène intégré doit être propulsé dans les cellules filles. Si le tissu est constitué de cellules qui ne se divisent pas, nous pouvons utiliser un vecteur non intégrateur. »

Des considérations supplémentaires incluent la spécificité du vecteur viral, le type des cellules ciblées et le potentiel de problèmes de toxicité et de génotoxicité.

Depuis que l’on a découvert en 2002 que certains patients traités par un transfert de gène médié par un vecteur gammaretroviral ont développé une leucémie due à une mutagenèse insertionnelle,3 le risque de génotoxicité a été un problème de sécurité pour la thérapie génique à base de cellules. Ce risque est associé non seulement à l’intégration de vecteurs rétroviraux mais aussi à des vecteurs non intégrateurs tels que les VAA.4 Bien que la faible immunogénicité des vecteurs VAA n’ait jusqu’à présent pas provoqué d’effets secondaires aigus, dans plusieurs essais cliniques, elle a déclenché une immunotoxicité qui pourrait entraver les résultats thérapeutiques.5,6

Enfin, il est important de prendre en compte la stabilité in vitro et in vivo du vecteur viral, ainsi que de déterminer le meilleur procédé pour le produire et le purifier en toute sécurité. Et c’est là qu’interviennent le Dr van der Loo et ses associés.

Comparaison des méthodes de production de vecteurs viraux

« Il existe trois façons de produire des vecteurs viraux : l’utilisation d’une lignée cellulaire d’emballage stable, d’une transfection transitoire ou d’une infection », explique le Dr van der Loo. « Pour ce dernier, je fais référence au système de baculovirus développé par Robert Kotin lorsqu’il était investigateur au NIH. Par souci de simplicité, dans cet article, je vais me concentrer uniquement sur les deux autres méthodes. »

Il commence par décrire les principes de base : L’utilisation d’une lignée de production stable comprend des gènes Gag/Pol et d’enveloppe intégrés de manière stable qui sont nécessaires pour fabriquer la particule virale. Ce qui manque, c’est la séquence du vecteur elle-même, qui est généralement introduite sous la forme d’un virus ou d’un plasmide. Parce que l’utilisation d’un plasmide est une méthode inefficace pour intégrer un vecteur viral, ils sont généralement produits à l’aide d’un virus.

Les cellules sont ensuite mises en culture, un clone est sélectionné, puis une banque de cellules maître est créée à partir de ce clone. Après la fabrication et la certification de la banque de cellules souches, chaque fois que les cellules sont décongelées et mises en culture, elles produisent le vecteur viral.

La fabrication avec une ligne de production stable est relativement simple et facile à évoluer. En général, il y a peu de variabilité entre les lots, bien que cette méthode soit intrinsèquement moins flexible.

« Après avoir choisi le vecteur viral et la séquence du gène, vous êtes bloqué », explique le Dr van der Loo, « car au moment où vous sélectionnez vos clones et créez votre banque de cellules maître, vous ne pouvez plus faire de changements. »

Contrairement à l’utilisation de lignées productrices stables, la transfection transitoire ne nécessite que trois jours, tous les vecteurs étant générés à partir d’une même banque de cellules.

« Ainsi, la génération d’un lot de vecteurs est relativement rapide et extrêmement flexible, car le vecteur peut être changé jusqu’au stade de la fabrication », dit-il.

Cependant, la fabrication est plus complexe et difficile à intensifier que lorsqu’elle utilise une ligne de production stable, et une plus grande variabilité entre les lots est possible si le processus n’est pas contrôlé de manière adéquate. Cela peut être dû au fait que le processus de transfection transitoire inclut invariablement une contamination plasmidique qui doit être éliminée pendant la fabrication et la purification.

Purification de particules virales par ultracentrifugation

Le Dr van der Loo et ses collègues utilisent une méthode de purification des particules virales qui consiste en l’ultracentrifugation en gradient de densité, qui sépare efficacement les virions pleins de ceux qui sont vides. En tant que solution iso-osmotique, l’iodixanol peut être utilisé pour toutes les densités requises pour cette méthode.

Compte tenu de la nature critique de la (des) application(s) en aval, l’utilisation de BPF est un facteur clé pour l’ultracentrifugation. Il est important de reconnaître que les tubes et les capuchons sont fournis en tant qu’éléments non stériles, et que la méthode de stérilisation, que ce soit le gamma, l’oxyde d’éthylène ou la chaleur, peut affecter l’intégrité du tube.

« C’est pourquoi nous consultons toujours les informations sur la compatibilité chimique et la stérilisation fournies avec ces matériaux », dit-il. « Et si ce processus est utilisé pour des essais cliniques de phase ultérieure, la méthode doit être validée. »

Il poursuit en décrivant le processus de purification de base que lui et ses collègues ont utilisé :

« Après avoir introduit le virus, qui a la densité la plus faible, nous plaçons diverses concentrations sous-jacentes d’iodixanol », dit-il, « en s’assurant que le ménisque est juste en dessous de l’embout du tube.

« Le tube est ensuite scellé, et, après le spin, le virus se rassemble dans la bande de 40 % d’iodixanol, se trouvant au-dessus de la bande de 54 %. Après avoir inséré une aiguille dans le haut pour briser le vide, nous utilisons une autre aiguille pour pénétrer dans le côté du tube en vue de récolter le virus. »

Comme il s’agit d’un processus non stérile, note-t-il, il est important de désinfecter le rotor avant la récolte et d’essuyer le tube avant la récolte du vecteur. Enfin, le Dr van der Loo conseille la filtration du produit final en utilisant au moins un filtre de 0,2 μm.

Il note également que ce processus nécessite une formation rigoureuse, car il peut être aussi exigeant que très efficace. « Nous l’avons utilisé pour produire avec succès des vecteurs VAA pour un essai clinique de phase IIA », dit-il, « qui nous a demandé d’effectuer un total de 480 gradients d’iodixanol. »

Défis cliniques pour l’utilisation de vecteurs viraux dans la thérapie génique

Exploiter des processus moléculaires complexes façonnés par des millions d’années d’évolution - les nôtres et les virus - comporte des défis, comme le reconnaît le Dr van der Loo.

« Pour commencer, identifier et atteindre le niveau approprié de correction génétique nécessaire pour une maladie spécifique est un défi énorme », dit-il. « Cela inclut le nombre de copies nécessaires, le nombre d’intégrations pour l’intégration des vecteurs, et le nombre de cellules qui peuvent être transduites. »

« Deuxièmement, il est important de définir le niveau d’expression du gène thérapeutique ; cela est généralement affecté par le choix du promoteur - fort ou faible - qui détermine si une expression de haut ou de bas niveau est atteinte. »

« Le troisième est le potentiel de mutagenèse insertionnelle. Nous savons que les vecteurs qui s’intègrent dans le génome peuvent affecter les gènes dans la zone d’intégration, et l’élimination du potentiel de mutagenèse insertionnelle est un défi permanent. »

« Un quatrième défi est le silençage génique, qui est une considération importante pour l’intégration des vecteurs, la réponse immunitaire à un vecteur (qui affecte le choix de la voie d’administration), le type et la pureté du vecteur, et la biodistribution. »

« Enfin, nous devons considérer l’expression hors cible, même si nous avons appris que l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus peut aider à relever ce défi. »

Autres leçons apprises

Après plusieurs années de travail dans le domaine de la thérapie génique, qu’est-ce que le Dr. van der Loo considère comme l’une des leçons les plus importantes qu’il a apprises ?

« Pour les essais cliniques de phase précoce, il est important d’effectuer des tests basés sur le risque de toutes les matières premières pour les critères de performance critiques, et, si possible, d’établir un accord de qualité avec tous les fournisseurs de matériaux. »

Il a également appris l’importance d’utiliser un processus technologique formalisé lors de la transition des processus de développement vers les BPF. « Et ne sous-estimez jamais le haut niveau de formation technique qui doit être atteint pour être prêt pour la fabrication », note-t-il.

« Enfin, investir dans des technologies évolutives pour la production à grande échelle. Dans certains cas, il peut s’agir de l’ultracentrifugation, et pour d’autres, il peut être judicieux d’envisager des alternatives telles que la chromatographie. »

Références :
1. Disponible à l’adresse : URL : https://globenewswire.com/news-release/2016/09/13/871431/0/en/Cancer-Gene-Therapy-Market-size-to-exceed-4-3bn-by-2024-Global-Market-Insights-Inc.html.
2. Disponible à l’adresse : URL : https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/gene-therapy-market-2015-2025/85.html.
3. Hacein-Bey-Abina S, Hauer J, Lim A, et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 2010;363(4):355–364.
4. Kaeppel C, Beattie SG, Fronza R, et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nat Med 2013;19(7):889–891.
5. Masat E, Pavani G, Mingozzi F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discov Med 2013;15(85):379–389.
6. Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood 2013;122(1): 23–36.

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