Automatisation: exécution de la procédure d’isolement des exosomes à votre place

L’ultracentrifugation différentielle a été décrite comme la méthode standard de référence pour l’isolement des exosomes1 en raison de son utilisation répandue et des fractions exosomales hautement purifiées qu’elle permet. L’automatisation des procédures d’isolement et de caractérisation en plusieurs étapes peut permettre d’accélérer les procédures et de gagner en précision, tout en réduisant le temps de manipulation et la variabilité entre les cycles. Malgré la simplicité apparente (plusieurs centrifugations à différentes vitesses), il peut s’avérer délicat de normaliser différentes étapes de la procédure impliquant des méthodes manuelles. Pour améliorer la qualité de vos exosomes isolés et toutes les données en dérivant, l’automatisation permet la reproductibilité, la traçabilité et la précision. Apprendre à automatiser peut permettre d’approfondir l’analyse, d’augmenter la flexibilité en aval et d’identifier avec plus de précision les petites modifications des chargements à différents moments et dans différentes conditions.

De la culture des cellules à la phase logarithmique

Remarque: Si votre matériel de départ est un fluide biologique issu d’une biopsie des fluides, vous pouvez ignorer ce conseil. 

Dans la plupart des laboratoires, la culture cellulaire jusqu’à la phase logarithmique est une seconde nature. Il suffit d’un peu de temps supplémentaire et d’un hémocytomètre. Ce n’est donc pas la culture des cellules jusqu’à la phase logarithmique qui nécessite une attention supplémentaire, mais la mise en plaque des cellules avant la culture jusqu’à la phase logarithmique. Malgré tous les efforts d’un scientifique, il arrive souvent que la numération cellulaire obtenue par hémocytomètre soit biaisée par différentes variables, dont l’agrégation, le manque d’homogénéité d’un mélange ou un calcul incorrect. Pour s’assurer que la densité cellulaire ne dévie pas de l’isolement des exosomes dès le départ, des compteurs de cellules fiables et l’automatisation de la manipulation de fluide pour l’ensemencement cellulaire peuvent apporter la précision et la normalisation parfois manquantes au quotidien dans la pratique de laboratoire. 

Des cellules sous-ensemencées ou sur-ensemencées nécessitent une étroite surveillance par spectrophotomètre afin de ne pas manquer la croissance jusqu’à la phase logarithmique. Des plaques ensemencées avec une numération cellulaire inappropriée peuvent ne pas être prêtes pour le prélèvement des exosomes au moment opportun. Les cellules ensemencées à une densité prédictible doivent atteindre la phase logarithmique à un moment prédictible, permettant d’effectuer le dosage dans les délais prévus. Lorsque vous utilisez des cellules de mammifères adhérentes, plusieurs cultures sont faites simultanément, ce qui permet d’évaluer la phase de croissance par spectrophotomètre sans interruption pour les cellules expérimentales. Au-delà des avantages évidents de la normalisation de la méthode d’ensemencement cellulaire, la familiarisation avec les attributs de croissance types des cellules peut contribuer à vous avertir de problèmes concernant les cellules ou les conditions de culture. Si les cellules atteignent généralement la confluence en 18 heures, mais qu’elles sont en retard ou en avance, ce peut être le moment de caractériser une nouvelle aliquote de cellules ou cela peut signaler un changement dans la composition du milieu de culture ou une modification des conditions d’incubation.

Pourquoi la phase de croissance logarithmique est-elle importante lors du prélèvement des exosomes?

Dans la mesure où les exosomes sont le critère d’évaluation souhaité, les conditions de culture cellulaire (et dans lesquelles les exosomes sont libérés) peuvent avoir un impact direct sur la qualité des exosomes et la valeur de leur chargement. Par exemple, les cellules dont la croissance a eu lieu dans des conditions de stress, comme celles des cultures en phase stationnaire surpeuplées, ont montré une variation du chargement exosomal du fait d’un environnement plus rude.2 Si votre objectif expérimental est de récapituler les charges exosomales par rapport aux conditions normales, il est important de s’assurer que les exosomes ont été prélevés au bon moment.

Connaître votre rotor pour une ultracentrifugation précise

Le recours à une ultracentrifugeuse partagée peut être impressionnant. C’est un équipement coûteux, et nous avons tous en tête le récit de personnes ayant utilisé des tubes inadaptés ou une conversion tr/min/fcr/g inappropriée, ce qui a endommagé la machine, sans parler de l’altération d’échantillons difficiles à obtenir. L’ultracentrifugation exige un niveau de précision élevé, non seulement lors de la préparation des échantillons, mais également lors de la sélection du rotor approprié pour la tâche en question. Le choix d’un rotor avec un facteur k réduit, qui dépend d’un calcul fondé sur la vitesse angulaire des rayons de la centrifugeuse, permet de bénéficier de la centrifugation différentielle la plus efficace de vos échantillons.1 Par exemple, un rotor à godets oscillants offre une plus grande variation entre le rayon minimal et le rayon maximal du rotor qu’un rotor à angle fixe, ce qui veut dire que des échantillons identiques doivent migrer plus rapidement et permettre une séparation plus précise des particules biologiques à l’intérieur du gradient de densité selon leur point isopycnique dans un rotor à angle fixe que dans un rotor à godets oscillants. Gardez à l’esprit que les facteurs k font référence à un rotor spécifique lorsqu’ils sont utilisés dans une centrifugeuse spécifique et doivent être recalculés pour chaque combinaison de rotor/centrifugeuse. La vitesse est une seconde variable à garder à l’esprit. Elle dépend du rotor utilisé et des réglages sélectionnés. Il est essentiel de vous assurer que les échantillons tournent à la vitesse appropriée pendant une durée appropriée pour que l’isolement des exosomes par ultracentrifugation différentielle réussisse. Pour réduire les risques de rotor inapproprié empêchant la séparation correcte des échantillons, sélectionnez un rotor en toute confiance grâce à l’outil de sélection de rotor de Beckman .

Préparation du gradient de densité

Les gradients de densité sont essentiels à la pureté des exosomes isolés, car ils exploitent la différence de densité entre les exosomes et d’autres particules de même taille, comme les virus et les petits corps apoptotiques, afin de les séparer les uns des autres de façon fiable. Les gradients de densité traditionnels ont été élaborés à partir de solutions de saccharose de plus en plus concentrées, mais de nouveaux protocoles ont exigé l’utilisation d’un gradient d’iodixanol pour améliorer la séparation et la stabilisation iso-osmotique de la taille des exosomes. D’autres méthodes d’isolement des exosomes sont proposées fréquemment, mais aucune n’a démontré de supériorité par rapport à l’ultracentrifugation par gradient de densité en ce qui concerne la pureté des exosomes et la diversité du chargement.3 Dans la mesure où le gradient de densité est essentiel pour la pureté des exosomes préparée par ultracentrifugation, il est crucial d’assurer une préparation précise des solutions constitutives et la superposition exacte du gradient. Pour ces raisons, la manipulation automatisée des fluides est un choix naturel. Un dispositif de manipulation automatisée des fluides peut superposer soigneusement les solutions d’iodixanol/de sucrose pour former un gradient de densité discontinu.

Détermination de la taille et de la concentration des exosomes

Une fois les exosomes isolés, ils peuvent être analysés directement pour déterminer leur chargement (protéines, lipides, acides nucléiques, etc.) ou être caractérisés de façon plus approfondie pour fournir des indices concernant leur cellule d’origine. L’analyse de la taille des exosomes, qui s’appuie sur le traçage des nanoparticules pour identifier la distribution de la taille des exosomes et leur concentration dans le diluant, est une étape de caractérisation habituelle qui peut être automatisée. Le dispositif d’analyse par traçage des nanoparticules (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) peut être intégré facilement à l’isolement complet des exosomes et à la caractérisation, ce qui permet une détermination précise et reproductible de la taille et de la concentration des exosomes.

Facilitation de l’analyse en aval

Le plus souvent, l’objectif final de l’isolement des exosomes est non seulement de prélever des exosomes, mais également d’étudier leur chargement pour comprendre cette forme de communication intercellulaire observée depuis peu. Les scientifiques sont parvenus à isoler l’acide désoxyribonucléique (ADN),4 l’acide ribonucléique (ARN)5, 6 et les protéines7, 8 des exosomes et les ont utilisés pour analyser les principaux composants et les impacts des petits messagers. Certaines de ces analyses (seq-ARN, par exemple) nécessitent des réactions assemblées soigneusement et de façon reproductible, ce que permet l’automatisation de la manipulation des fluides, tandis que d’autres techniques (ELISA, par exemple) nécessitent des fonctions de préparation des plaques, d’incubation et de lecture des plaques, toutes programmables dans une procédure fluide avec une automatisation intelligente et flexible. 

L’isolement des exosomes par ultracentrifugation différentielle est une méthode efficace et fiable pour un enrichissement de haute pureté. La procédure en plusieurs étapes nécessite une précision et une reproductibilité extrêmes faisant de l’automatisation un choix naturel. Pour en savoir plus sur l’automatisation de l’isolement et de la caractérisation des exosomes, commencez par lire cette note d’application.

Références:

  1. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
  2. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., and Mittelbrun, M. Sorting it out: Regulation of Exosome Loading. Semin. Cancer Biol. (2014) 28:3-13. doi: 10.1016/j.semcancer.2014.04.009.
  3. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles. (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.
  4. Lazaro-Ibanez, E., Sanz-Garcia, A. Visakorpi, T., Escobedo-Lucea, C., Siljander, P., Ayuso-Sacido, A., et al. Different gDNA content in the subpopulations of prostate cancer extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles, and exosomes. Prostate. (2014) 74:1379-90. doi: 10.1002/pros.22853.
  5. Stevanato, L., Thanabalasundraram, L., Vysokov, N., and Sinden, J.D. Investigation of Content, Stoichiometry and Tarnsfer of miRNA from Human Neural Stem Cells Line Derived Exosomes. PLoS One. (2016) 11:e0146353. doi: 10.1371/journal.pone.0146353. 
  6. San Lucas, F.A., Allenson, K., Bernard, V., Castillo, J., Kim, D.U., Ellis, K., et al. Minimally invasive genomic and transcriptomic profiling of visceral cancers by next-generation sequencing of circulating exosomes. Ann. Oncol. (2016) 27:635-41. doi: 10.1093/annonc/mdv604.
  7. Winston, C.N., Goetzl, E.J., Akers, J.C., Carter, B.S., Rockenstein, E.M., Galasko, D., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. (Amst). (2016) 3:63-72. doi: 10.1016/j.dadm.2016.04.001.
  8. Lasser, C., O-Neil, S.E., Shelke, G.V., Sihlbom, C., Hansson, S.F., Gho, Y.S., et al. Exosomes in the nose induce immune cell trafficking and harbour an altered protein cargo in chronic airway inflammation. J. Transl. Med. (2016) 14:181. doi: 10.1186/s12967-016-0927-4.


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