Grâce aux exosomes, la modélisation des maladies atteint un niveau inédit : «de la cage à la plaque»

Historiquement, les méthodes les plus répandues pour étudier le processus d’une maladie ont impliqué le développement d’un modèle animal et l’analyse histologique des tissus et de la biochimie des altérations de l’expression des protéines. Mais une avancée en biologie cellulaire est sur le point d’avoir un impact important sur la façon dont nous pensons l’étude des maladies. Les exosomes sont de petites vésicules (< 120 nm) liées aux membranes, libérées par les cellules dans le liquide interstitiel où baignent les cellules environnantes. En raison de leur mode de formation, c’est-à-dire par bourgeonnement de l'endosome puis fusion avec la membrane plasmique, les exosomes contiennent un échantillonnage de l’acide désoxyribonucléique (ADN), de l’acide ribonucléique (ARN) et des protéines de leur cellule d’origine, dont les marqueurs de surface cellulaire.1 En isolant les exosomes, généralement à partir d’une biopsie des fluides, il est possible d’analyser les macromolécules constitutives présentes dans les exosomes et d’en tirer des conclusions sur la santé de leurs cellules, organes ou organismes d’origine.2 Cela signifie que plutôt que de prélever le rein d’une souris, d’effectuer des coupes en série ou un transfert Western blot et de réaliser une coloration avec un marqueur phénotypique de la maladie, il est possible de mettre en culture des lignées cellulaires spécifiques de la maladie, d’isoler les exosomes du milieu de culture cellulaire conditionné et de profiler les protéines, l’ADN et l’ARN qui s’y trouvent.3 Un débit supérieur, des coûts réduits et des informations spécifiques pertinentes pour l’homme sont autant de raisons d’envisager d’explorer l’univers des exosomes. 

Les exosomes au cours d’une maladie

Tout comme les exosomes sont libérés par la plupart, sinon la totalité, des cellules humaines saines, ils sont également libérés par les cellules en mauvaise santé, stressées ou malades. Il en résulte que le chargement contenu dans les exosomes libérés par ces cellules serait évocateur de cet état de mauvaise santé, de stress ou de maladie. Les biopsies des fluides ont confirmé, effectivement, que les exosomes circulants de patients atteints de certaines maladies peuvent contenir des protéines aberrantes4-6 et des acides nucléiques favorisant la maladie.7, 8 Il a même été mis en évidence la transmission de ces états d’un organisme à l’autre au moyen d’une transfusion d’exosomes.
Lors du passage de l’état sain à la maladie, les macromolécules constitutives contenues dans les exosomes changent pour refléter l’homéostasie modifiée par la charge de la maladie9, 10, alors que le nombre d’exosomes libérés augmente.11 Ce phénomène est causé par l’élévation du calcium intracellulaire dans ce qui pourrait être une tentative pour signaler la détresse cellulaire aux cellules voisines. L’isolement et le profilage des exosomes à partir de cellules ou de tissus d’une pathologie connue peut donc éclairer non seulement sur la fonction biologique de ces messagers cellulaires, mais également sur les identités des cibles thérapeutiques potentielles définies précédemment.12 

 

Récapitulatif de la maladie in vitro

S’il est vrai que certaines recherches sur les maladies des exosomes sont conduites à partir d’échantillons de fluides provenant du patient (urine, salive, sang, etc.), il existe une autre méthode d’analyse du profil exosomal de différentes maladies. Il a été montré que les lignées cellulaires en culture libèrent des exosomes dans le milieu de culture, et il existe des éléments de preuve concernant la comparabilité des exosomes dérivés de lignées cellulaires et des exosomes dérivés du patient pour des diagnostics similaires.13-17 Il apparaît que les lignées cellulaires prélevées chez des patients atteints d’une maladie spécifique maintiennent leur profil exosomal au fil du temps, libérant uniformément des exosomes de la même composition. Différents profils d’exosomes de maladie ont été caractérisés,18-23 permettant d’extrapoler les exosomes libérés par des lignées cellulaires à des exosomes dérivés d’une biopsie des fluides. Cela permet d’utiliser des échantillons d’exosomes dérivés de biopsies des fluides non invasives ou minimalement invasives, servant de tests diagnostiques pour les biomarqueurs exosomaux de la maladie. 

 

Les lignées cellulaires sont dérivées d’échantillons de tissus, en général à la suite d’une biopsie tissulaire ou d’une résection chirurgicale de tissus malades. Certaines lignées cellulaires spécifiques à une maladie peuvent survivre en culture pendant des périodes prolongées en raison de l’immortalisation spontanée des cellules tumorales, mais les cellules peuvent être immortalisées en laboratoire en induisant l’expression d’un oncogène, comme le gène E1A. Les lignées cellulaires normales ou saines sont créées de cette façon. Les lignées cellulaires primaires, par ailleurs, ne sont pas immortelles et ne peuvent se diviser qu’un nombre limité de fois avant la sénescence ou l’apoptose cellulaire. Ainsi, les cellules primaires ne sont pas une source d’exosomes idéalement reproductible pour l’étude en culture, car leur préparation ne peut pas être contrôlée et répliquée de façon appropriée. Les bonnes pratiques dictent la comparaison de lignées cellulaires suffisamment similaires, de sorte que seul l’état de maladie influence le profil des exosomes. Pour obtenir des données les plus interprétables possible, comparez les exosomes produits par une lignée de cellules de mélanome aux exosomes produits par une lignée de cellules de mélanocyte et non avec une lignée cellulaire de cancer du côlon. 

Des lignées cellulaires modifiées peuvent être exploitées pour générer des exosomes en modifiant une lignée cellulaire existante et en modifiant ou spécifiant le chargement de ses exosomes à l’aide de différentes techniques de biologie moléculaire et de modification du génome. La conjugaison de protéines fluorescente ou bioluminescentes afin de suivre le trafic des exosomes et la modification de la séquence de la protéine cargo, de l’ADN ou de l’ARN ou pour l’étude en aval de la fonction exosomale sont des exemples d’utilisation de lignées cellulaires modifiées pour produire des exosomes personnalisés.24

Analyse phénotypique : la magie des marqueurs

La génération et l’isolement des exosomes ne constituent que la première étape de la caractérisation de la maladie in vitro. L’étape suivante consiste à profiler les exosomes isolés par une série de marqueurs phénotypiques pour confirmer la cellule d’origine de l’exosome et à comparer les modifications du profil des lignées cellulaires à l’état de maladie avec le profil des lignées cellulaires à l’état normal. Les marqueurs phénotypiques utilisés pour caractériser les profils des exosomes sont des anticorps qui reconnaissent les protéines présentes dans la double couche lipidique et dans le compartiment vésiculaire des exosomes. 

 

Même s’il n’y a pas de consensus sur un panel de marqueurs pouvant confirmer l’identité d’un exosome, différents marqueurs sont utilisés pour identifier les exosomes. Les marqueurs comme CD9, C81, MHC classe 2 font partie des marqueurs couramment admis pour les exosomes. L’identification des exosomes peut également être une procédure d’exclusion en excluant les microvésicules positives au GM130 et à la calnexine, qui sont dérivées de parties de la cellule d’origine qui ne sont pas impliquées dans la biogenèse des exosomes. Pour des informations spécifiques concernant la cellule d’origine, les exosomes peuvent également être colorées pour les marqueurs spécifiques de la ou des lignées cellulaires afin d’identifier spécifiquement le type de cellule à partir de laquelle ils ont été libérés.

L’imagerie par cytométrie en flux est une méthode courante pour analyser des exosomes identifiés d’un point de vue phénotypique, qui peut confirmer la taille et la forme de l’exosome, mais les exosomes peuvent être analysés par immunofluorescence, microscopie électronique, transfert Western blot ou ELISA. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut donc être utilisée pour caractériser le composant d’acide nucléique des exosomes.

La caractérisation des maladies avec des exosomes dérivés de lignées cellulaires offre différents avantages par rapport aux méthodes d’analyse de l’état de la maladie classiques, dont un débit supérieur, des coûts réduits et l’applicabilité directe à la maladie chez l’homme. Pour plus d’informations sur les exosomes dans la recherche sur les maladies, dont l’utilisation d’exosomes comme nanomatériel pour la délivrance de médicaments, consultez LIEN VERS LA PAGE DE RÉSUMÉ D’ARTICLES SUR LES EXOSOMES.

Références

  1. Keerthikumar, S., Gangoda, L., Liem, M., Fonseka, P., Atukorala, I., Ozcitti, C., et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget. (2015) doi: 10.18632/oncotarget.3801.
  2. Momen-Heravi, F., Balaj, L., Alian, S., Mantel, P-Y., Halleck, A.E., Trachtenberg, A.J., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biol. Chem. (2013) 394:1253-62. doi: 10.1515/hsz-2013-0141.
  3. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.
  4. Emmanouilidou, E. and Vekrellis, K. Exocytosis and Spreading of Normal and Aberrant α-Synuclein. Brain Pathol. (2016) 26:398-403. doi: 10.1111/bpa.12373.
  5. Fraser, K.B., Rawlins, A.B., Clark, R.G., Alcalay, R.N., Standaert, D.G., Liu, N., et al. Ser(P)-1292 LRRK2 in urinary exosomes is elevated in idiopathic Parkinson’s disease. Mov. Disord. (2016) doi: 10.1002/mds.26686. [Epub ahead of print]
  6. Jeon, I., Cicchetti, F., Cisbani, G., Lee, S., Li, E., Bae, J., et al. Human-to-mouse prion-like propagation of mutant huntingtin protein. Acta Neuropathol. (2016) doi: 10.1007/s00401-016-1582-9.
  7. Zhang, J., Li, S., Li, L., Li, M.,Guo, C., Yao, J., et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function. Genomics Proteomics Bioinformatics. (2015) 13:17-24. doi: 10.1016/j.gpb.2015.02.001.
  8. Ye, S.B., Li, Z.L., Luo, D.H., Huang, B.J., Chen, Y.S., Zhang, X.S., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human naspharyngeal carcinoma. Oncotarget. (2014) 5:5439-52. doi: 10.18632/oncotarget.2118.
  9. Lin, J., Li, J., Huang, B., Liu, J., Chen, X., Chen, X-M., et al. Exosomes: Novel Biomarkers for Clinical Diagnosis. ScientificWorldJournal. (2015) 6557086:1-8. doi: 10.1155/2015/657086.
  10. An, T., Qin, S., Xu, Y., Tang, Y., Huang, Y., Situ, B., et al. Exosomes Serve as Tumour Markers for Personalized Diagnostics Owing to Their Important Role in Cancer Metastasis. J. Extracell. Vesicles. (2015) 4:27522. doi: 10.3402/jev.v4.27522.
  11. Zhang, X., Yuan, X., Shi, H., Wu, L., Qian, H., and Xu, W. Exosomes in cancer: small particle, big player. J. Hematol. Oncol. (2015) 8:83. doi: 10.1186/s13045-015-0181-x.
  12. Valenzuela, M.M., Ferguson Bennit, H.R., Gonda, A., Diaz Osterman, C.J., Hibma, A. Khan, S., et al. Exosomes Secreted from Human Cancer Cell Lines Contain Inhibitors of Apoptosis (IAP). Cancer Microenviron. (2015) 8:65-73. doi: 10.1007/s12307-015-0167-9. 
  13. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., and Mongini, C. Emerging Roles of Exosomes in Normal and Pathological Conditions: New Insights for Diagnosis and Therapeutic Appliations. Front. Immuno. (2015) 6:203. doi: 10.3389/fimmu.2015.00203.
  14. Ipas, H., Guttin, A., and Issartel, J.P. Exosomal MicroRNAs in Tumoral U87 MG Versus Normal Astrocyte Cells. MicroRNA. (2015) 4:131-45. 
  15. Skog, J., Wurdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D.H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., et al. Glioblastoma microvesicle transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat. Cell Bio. (2008) 10:1470-6. doi: 10.1038/ncb1800.
  16. Akers, J.C., Ramakrishnan, V., Kim, R., Phillips, S., Kaimal, V., Mao, Y., et al. miRNA contents of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in glioblastoma patients. J. Neurooncol. (2015) 123:205-26. doi: 10.1007/s11060-015-1784-3.
  17. Jenjaroenpun, P., Kremenska, Y., Nair, V.M., Kremenskoy, M., Joseph, B., and Kurochkin, I.V. Characterization of RNA in exosomes secreted by human breast cancer cell lines using next-generation sequencing. PeerJ. (2013) 1:e201. doi: 10.7717/peerj.201.
  18. Bellingham, S.A., Coleman, B.M., and Hill, A.F. Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells. Nucl. Acids Res. (2012) 40:10937-49. doi: 10.1093/nar/gks832.
  19. Belov, L., Matic, K.J., Hallal, S., Best, O.G., Mulligan, S.P., and Christopherson, R.I. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic sigantures from blood samples. J. Extracell. Vesicles. (2016) 5:25355. doi: 10.3402/jev.v5.25355.
  20. Xiao, D., Ohlendorf, J., Chen, Y., Taylor, D.D., Rai, S.N., Waigel, S., et al. Identifying mRNA, MicroRNA and Protein Profiles of Melanoma Exosomes. PLOS one. (2012) 7: e46874. doi:10.1371/journal.pone.0046874.
  21. Zhong, S., Chen, X., Wang, D., Zhang, X., Shen, H., Yang, S., et al. MicroRNA expression profiles of drug-resistance breast cancer cells and their exosomes. Oncotarget. (2016) doi: 10.18632/oncotarget.7481. [Epub ahead of print]
  22. Taylor, D.D., and Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos. Trans. R. So.c Lond. B Biol. Sci. (2014) 369:pii: 20130503. doi: 10.1098/rstb.2013.0503.
  23. Ogata-Kawata, H., Izumiya, M., Kuioka, D., Honma, Y., Yamada, Y., Furuta, K. et al. Circulating Exosomal microRNAs as Biomarkers of Colon Cancer. PLOS one. (2014) 9: e92921. doi:10.1371/journal.pone.0092921.
  24. Hood, J. Post isolation modification of exosomes for nanomedicine applications. Nanomedicine. (2016) 11:1745-56. doi: 10.2217/nnm-2016-0102.

Contactez-nous


















Veuillez me tenir informé des séminaires en ligne et des nouveautés concernant les produits et les services de Beckman Coulter, y compris les produits et les services de nos sociétés rattachées.


En soumettant ce formulaire, je confirme que j'ai examiné et accepté la politique de confidentialité et les conditions d'utilisation. Je comprends également mes choix de confidentialité en ce qui concerne mes données personnelles, comme indiqué dans la politique de confidentialité décrite dans «Vos choix de confidentialité».