Isolement et caractérisation des exosomes pour les dosages et les approches « -omiques »

L’isolement des exosomes peut être techniquement difficile lors du processus de purification en raison de la persistance de contaminants, comme les microvésicules, les particules de lipoprotéines, les microbes, les microsomes, les agrégats de protéines et l’acide désoxyribonucléique (ADN) et d’autres produits de nécrose.1 Cela rend difficile la caractérisation précise des exosomes et leur utilisation pour des dosages et des applications en aval.1 La caractérisation des exosomes est importante pour la compréhension de leurs propriétés et de leurs fonctions et  l’identification des protéines marqueurs uniques des exosomes peut aider à développer une méthode pour évaluer la présence d’exosomes dans des échantillons. La normalisation des méthodes d’isolement a le potentiel d’entraîner une augmentation de la quantité et de la qualité des exosomes et une amélioration de la reproductibilité des résultats obtenus lors de l’utilisation de préparations d’exosomes. Alors que le rôle potentiel des exosomes dans le diagnostic et le traitement des maladies a attiré l’attention, la détermination de la pureté des échantillons d’exosomes est une exigence absolue avant de pouvoir utiliser les technologies liées aux exosomes dans un cadre clinique, dans la mesure où cela peut entraîner des effets secondaires indésirables. Dans le contexte de diagnostics cliniques, la présence de contaminants dans un échantillon peut entraîner des faux négatifs ou des faux positifs, aboutissant à un diagnostic erroné pour le patient.2

 

Méthodes d’isolement des exosomes

Les exosomes sont sécrétés par la plupart des types de cellule et peuvent donc être isolés à partir de cultures cellulaires et de fluides corporels, dont le plasma, l’urine, la salive, le sérum et le liquide céphalorachidien.3 Les protocoles d’isolement d’exosomes ont été adaptés à chaque type d’échantillon sur la base de paramètres variables, tels que la vitesse de centrifugation, l’utilisation de la filtration et d’un gradient de densité ainsi que d’autres techniques.1 La méthode d’isolement et de purification des exosomes la plus utilisée est l’ultracentrifugation différentielle,4 par laquelle des séries de rotations facilitent l’élimination progressive des contaminants, comme les cellules mortes, les débris de cellules, les plaquettes, les protéines et les complexes et agrégats d’acide nucléique ainsi que d'autres contaminants provenant de l'isolât.1 En revanche, les contaminants non exosomaux, comme les particules de lipoprotéine, les virus et les bactéries, les microsomes, l’ADN et les produits de nécrose (comme les corps apoptotiques) et les agrégats protéiques peuvent subsister.

D’autres techniques d’isolement des exosomes souvent utilisées en combinaison avec une centrifugation différentielle, sont les suivantes : gradient de densité d’iodixanol, précipitation, ultrafiltration, isolement par immuno-affinité, chromatographie d’exclusion de taille et techniques microfluidiques.5 Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients. La méthode doit donc être choisie soigneusement afin de servir au mieux l’application en aval. De plus, certaines méthodes d’isolement et de purification peuvent permettre d’obtenir le rendement de protéines le plus élevé, mais rendre les vésicules non viables pour certaines applications.5 Par exemple, la chromatographie d’exclusion de taille permet de produire des échantillons très purs avec une contamination, des coûts et une durée de traitement relativement limités. Toutrefois l’échantillon final peut être considérablement dilué. Un seul échantillon peut être traité à la fois, et la procédure peut nécessiter une main-d’œuvre importante.5

Le contenu non exosome d’un échantillons représente un défi majeur pour l’analyse des caractéristiques des exosomes, de même que pour leur utilisation pour des dosages ou d’autres approches.1 Les particules de lipoprotéine, les microbes, les microsomes, les agrégats de protéines, l’ADN et d’autres produits de nécrose sont des contaminants qui peuvent être difficiles à éliminer dans les préparations de vésicules.1 En fonction de l’application prévue en aval pour les exosomes purifiés, d’autres étapes peuvent être exécutées pour éliminer les contaminants de l’échantillon d’exosomes purifié. Il a été démontré, par exemple, que les préparations d’exosomes générées avec un gradient de densité d’iodixanol permettent d’obtenir une grande pureté, comme en témoignent l’enrichissement du marqueur exosomal CD63 et l’absence de protéines contaminantes, comme les complexes extracellulaires Argonaute-2.6 Pour estimer la quantité de protéines contaminantes, il est fréquent de comparer le rapport entre la numération de nanovésicules (obtenue par des technologies de visualisation de vésicules, comme la plateforme NanoSight) et la concentration en protéines (obtenue par dosages colorimétriques de protéines, comme le dosage BCA).7 La présence de protéines de contamination affecte ce rapport et peut permettre d’estimer la pureté de l’échantillon exosomal. Il a été rapporté que des échantillons présentant des ratios plus élevés que 3 x 1010 particules par µg de protéines sont considérés comme très purs, tandis que des ratios de 2 × 109 à 2 × 1010 particules par µg de protéines sont considérés comme étant de faible pureté.7 Lors de l’élaboration d’un protocole d’isolement, il est recommandé d’évaluer l’échantillon et de l’optimiser non seulement en matière de présence d’exosomes, mais également d’absence de facteurs de contamination.

Caractérisation des exosomes

Différentes stratégies courantes permettent de déterminer la quantité et la pureté des exosomes et d’approfondir la caractérisation des vésicules à la suite de la purification.5 Lorsque l’analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) est utilisée conjointement à l’ultracentrifugation analytique, elle enrichit sélectivement les exosomes dans une plage de taille donnée en fonction de leur signature de diffusion de la lumière. La spectrométrie de masse peut être utilisée pour identifier les chargements de protéines dans les exosomes et déterminer si l’échantillon peut contenir des agrégats de protéines ou d’autres contaminants.5 La microscopie électronique peut être utilisée pour visualiser la morphologie des vésicules et leur taille et, lorsqu’elle est utilisée conjointement à l’immunomarquage, les caractéristiques spécifiques des exosomes, comme les protéines de surface.1 Le transfert Western blot classique peut détecter la présence de certaines protéines dans l’échantillon, mais ne peut pas déterminer la quantité d’exosomes. D’autres techniques sont utilisées pour évaluer la qualité et la quantité des préparations d’exosomes : microscopie à force atomique, suivi optique de particule unique, cytométrie de flux et détecteur impulsionnel à effet résistif.1

 

Différents marqueurs d’exosomes ont été identifiés et utilisés pour confirmer la présence d’exosomes dans les préparations.8 Les marqueurs protéiques courants sont Alix, TSG101, CD9, CD63 mais aussi d’autres protéines dont on pense qu’elles sont enrichies dans les exosomes comme la DIP2B et les 4 membres de la famille des protéines transmembranaires.2 Cependant, les exosomes ne contiennent pas tous ces protéines. La base de données en ligne ExoCarta (http://www.exocarta.org/) est un outil qui aide les chercheurs à identifier et à caractériser les chargements des exosomes. La base de données contient les protéines, les séquences d’acide ribonucléique (ARN) et les lipides identifiés dans des préparations exosomales spécifiques. Au final, l’identification des marqueurs protéiques des exosomes provenant de tumeurs, par exemple, peut être utilisée pour développer des tests de diagnostic clinique pour les tumeurs de patients.
La normalisation de l’isolement et de la caractérisation des exosomes est une étape essentielle pour obtenir des résultats fiables et reproductibles à partir de dosages et d’autres applications en aval, dont des applications cliniques et thérapeutiques. Les sources innombrables de prélèvement d’exosomes et la variété des techniques d’isolement ont présenté de nombreux défis pour la normalisation des protocoles et l’obtention de résultats cohérents et reproductibles.1 Découvrez comment l’automatisation des procédures peut aider à améliorer l’isolement et la caractérisation des exosomes.

Références :

1. Witwer, K. W., Buzás, E. I., Bemis, L. T., Bora, A., Lässer, C., Lötvall, J., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.20360.

2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H.-J., Takahashi, N. and Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J. Clin. Invest. (2016) 126, 1152–1162. doi: 10.1172/JCI81129.

3. El Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O. and Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat. Rev. Drug Discov. (2013) 12, 347–357. doi: 10.1038/nrd3978.

4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G. & Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Editor. Board Juan Bonifacino Al (2006) Chapter 3, Unit 3.22. doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.

5. Abramowicz, A., Widlak, P. and Pietrowska, M. Proteomic analysis of exosomal cargo: the challenge of high purity vesicle isolation. Mol. Biosyst. (2016) 12, 1407–1419. doi: 10.1039/c6mb00082g.

6. Van Deun, J., Mestdagh, P., Sormunen, R., Cocquyt, V., Vermaelen, K., Vandesompele, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. Vesicles (2014) 3. doi: 10.3402/jev.v3.24858.

7. Webber, J. and Clayton, A. How pure are your vesicles? J. Extracell. Vesicles (2013) 2. doi: 10.3402/jev.v2i0.19861.

8. Mathivanan, S. and Simpson, R. J. ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics (2009) 9, 4997–5000. doi: 10.1002/pmic.200900351.

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